Задачи и решения
Главная » Новости » Гетеродуплексный анализ и пиросеквенирование в диагностике истинной полицитемии

Гетеродуплексный анализ и пиросеквенирование в диагностике истинной полицитемии

RuLIS - Гетеродуплексный анализ и пиросеквенирование в диагностике истинной полицитемии

Соматические мутации в 533—547 кодонах 12-го экзона гена JAK2 высокоспецифичны для подтверждения диагноза истинной полицитемии (ИП). Частота встречаемости таких мутаций среди больных составляет от 3 до 23% в разных этнических группах. Метод анализа мутаций в 12-м экзоне гена JAK2 в количественном формате методом пиросеквенирования имеет высокую стоимость, что  определяет необходимость разработки двухэтапного алгоритма тестирования с предварительным использованием более доступного скринингового теста, предложенного авторами статьи.

Цель — продемонстрировать возможность использования метода гетеродуплексного анализа с последующим электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ) для выявления ИП-специфических мутаций в 12-м экзоне гена JAK2 в качестве предварительного скринингового теста.

Материал и методы. В работе были использованы пробы венозной крови: 28 женщин (средний возраст 53,1±14,9 года) и 112 мужчин (средний возраст 44,2±15,2 года), направленных врачами-гема-тологами с подозрением на ИП. После выделения ДНК проводили ПЦР с дополнительным этапом образования гетеродуплексов с использованием набора реагентов ПЦР-комплект («Синтол», Москва) на приборе CFX-96 («Bio-Rad», США). ПЦР-продукты детектировали методом электрофореза в 8% ПААГ. Подтверждение, идентификацию и количественный анализ уровня аллельной нагрузки выявленных мутаций проводили методом пиросеквенирования на приборе PyroMark Q24 («Qiagen», Германия).

Результаты. Среди всех V617F-негативных пациентов, обследованных нами, использование метода гетеродуплексного анализа с последующим электрофорезом в ПААГ позволило идентифицировать 4 образца, содержащие мутации в области 12-го экзона гена JAK2. Тип мутации для этих пациентов определен методом пиросеквенирования: N542-E543del (c.1624_1629delAATGAA); I540-E543delinsKK (с.1619_1627 TCAgAAATgK (c.1622_1627delGAAATG).

Выводы. Предлагаемый вариант гетеродуплексного анализа с детекцией в ПААГ может быть рекомендован к использованию как скрининговый тест, предшествующий подтверждающему количественному тесту в реакции пиросеквенирования. Двухэтапный подход позволяет оптимизировать алгоритм и повысить эффективность тестирования пациентов с подозрением на мутации в 12 экзоне гена JAK2.

Источник.  Т.Н. СУББОТИНА, А.Е. ХАРСЕКИНА, Е.А. ДУНАЕВА, К.О. МИРОНОВ, Е.В. ВАСИЛЬЕВ, М.А. МИХАЛЁВ, В.А. ХОРЖЕВСКИЙ, И.А. ОЛЬХОВСКИЙ, Г.А. ШИПУЛИН. Использование гетеродуплексного анализа и пиросеквенирования в  алгоритме диагностики истинной полицитемии, ассоциированной с  соматическими мутациями в 12-м экзоне гена JAK2.

Журнал "Лабораторная служба". -  Том 6 - №1, 2017 - С. 29-34

SSL Certificates